EGFR信号途径和非小细胞肺癌个体化诊治进展

EGFR信号途径和非小细胞肺癌个体化诊治进展 [标签:url] [标签:科室] 摘要：结直肠癌患者中BRAF突变能降低Panitumumab或Cetuximab 。通过对132例患者的回顾性研究分析，治疗有效者均无BRAF突变，而79例无效患者中11位(14.0%)有BRAFV600E等位基因突变。 非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌的80%，外科手术是最有效的治疗方法，但仅适用于NSCLC中的一小部分无或局限性转移的患者，并且很多患者手术治疗后仍会复发转移。近年来表皮生长因子受体（EGFR）在肺癌致瘤中的作用以及针对EGFR的靶向治疗备受关注，病理学家在如何筛选合理的EGFR靶向治疗对象及判定检测结果中起着关键的作用。本文总结了EGFR突变、基因拷贝数、EGFR过表达、磷酸化以及EGFR通路下游靶基因改变在预测NSCLC患者EGFR靶向治疗 最新研究成果。同时阐述了KRAS和BRAF突变以及ALK基因重排在肺癌靶向治疗中的作用。 一、EGFR概述 EGFR及其家族成员通过调节细胞增生、凋亡、迁移及 血管生成发挥重要的致癌作用。EGFR信号分子改变涉及多种恶性 发生、发展。尽管EGFR突变通过何种信号途径致癌的机制还不完全清楚，但明确的是EGFR突变能增强酪氨酸蛋白激酶活性。人类癌症相关体细胞突变目录（COSMIC）中提供了有关NSCLC有意义的基因突变及靶向治疗耐药相关的突变基因信息(COSMIC，<http：//www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/add_info/>)。EGFR基因位于7号染色体短臂7p12区，全长200kb，包含28个外显子，是编码464个氨基酸的蛋白质。它的活化依靠与其配体结合。配体一旦与EGFR结合，受体形成同源或异源二聚体，活化自身酪氨酸蛋白激酶。配体结合引起的受体二聚化可导致胞内酪氨酸残基自身磷酸化，磷酸化是下游信号的关键分子事件。EGFR可以激活下游多种信号途径，参与调节细胞增殖，分化，迁移以及存活(图1)。EGFR在许多实体 的生长和存活中发挥着重要作用。EGFR突变影响EGFR活化及过表达，而导致 的发生。EGFR受体酪氨酸激酶可以通过两个信号通路调节细胞增殖与存活：PI3K/AKT/mTOR信号通路以及RAS/RAF/MEK/MAPK信号通路。这些下游信号途径参与调节细胞增殖、凋亡、迁移、存活等重要生理过程，也参与调节 血管生成及 形成。 基于EGFR基因激酶域基因突变理论研制的针对EGFR酪氨酸激酶的靶向药物治疗给NSCLC患者带来了新的治疗契机。抗EGFR的靶向治疗主要有两种方式：EGFR单克隆抗体(如Cetuximab、Panitumumab)以及小分子EGFR酪氨酸激酶拮抗剂(EGFR-TKI)。大规模III期临床试验结果显示临床有效率15%到37.5%。临床试验表明多种有EGFR突变的 对EGFR-TKI敏感，临床有效率10%-30%。应用最广的EGFR-TKIs是吉非替尼（Gefitinib）和厄洛替尼（Erlotinib）。这类药物是可逆性抑制剂，它们通过竞争ATP结合在EGFR-TK上的活化位点发挥作用，主要用于铂类药物化疗失败的病人。已有222篇相关文献证实EGFR突变可预测晚期NSCLC患者EGFR-TKI单药 。 二、EGFR原癌基因突变、DNA拷贝数、蛋白表达以及EGFR下游信号分子的改变和NSCLC患者EGFR靶向治疗的关系 2.1EGFR突变 EGFR突变可使TK受体组成性活化，并与EGFR-TKIs敏感性相关。伴有这些突变的患者接受Erlotinib或Gefitinib治疗后反应率常大于70%。受体的不同突变位点具有不同的特点，而大多数突变会影响ATP结合位点，这也是TKI针对的靶点(图2)。 体外实验表明EGFR突变增强TK活性，从而提高了 细胞对EGFR抑制剂的敏感性。研究发现TKI治疗有效者常有EGFR基因第19号及21号外显子突变，这些基因突变可用于筛选EGRF靶向治疗对象。最常见的突变是第19号外显子上第745密码子开始缺失4个高度保守性氨基酸(LREA)。EGFR突变者TKI治疗有效率及无病生存期明显好于无突变者。 目前检查突变最常用方法包括直接测序法及实时定量PCR，其它还有聚合酶链式反应-单链构象多态(PCR-SSCP)分析和高分辨率熔解曲线分析(HRMA)，蝎形探针扩增阻滞突变系统及多靶实时定量PCR检测试剂盒用于检测 中常见的EGFR体细胞突变。这些敏感性和特异性高的试剂盒即使在混有野生型基因组DNA情况下，也能有效地检测出EGFR突变。DxSScorpions？技术可检测第19号外显子缺失突变(T790M，L858R，L861Q，G719Xs，S768I)以及外显子中的3个插入突变(2307_2308ins9，2319_2320insCAC和2310_2311insGGT)。与直接测序相比，其它两种方法在快速检测EGFR突变上具有更高的特异性及敏感性。但临床仍需应用直接测序验证基因突变。目前国际上无EGFR基因突变检测的指南，在检测步骤中还需说明EGFR突变位点的检测数目。Jackman等发现223例未接受化疗的晚期NSCLC患者中，EGFR突变者TKI治疗反应率为67%，疾病恶化时间为11.8个月，总体生存时间为23.9个月。与第21号外显子L858R点突变相比，第19号外显子缺失具有更长的中位疾病恶化时间及总体生存时间。无论KRAS突变状态，野生型EGFR突变预后常较差(治疗反应率，3%；疾病恶化时间，3.2个月)。对于筛选EGFR-TKI一线治疗对象的指标而言，EGFR基因型优于临床参数。 研究表明大于75%EGFR-TKI治疗有效者具有EGFR突变活性。但是，一些伴有EGFR常见突变的二次突变常常对EGFR-TKI靶向治疗有耐药性。EGFR基因第20外显子突变常对Gefitinib治疗无反应。而且，第20外显子二次突变T790M占获得性耐药的50%。外周血循环 细胞的耐药性突变位点的检测可早期确定是否具有获得性耐药。 一些临床前期试验表明EGFR-TKIs 获益不仅仅局限EGFR基因突变者。可能突变基因以外的分子机制也发挥着一定作用。EGFR基因扩增以及受体/配体过表达等与EGFR抑制剂单药敏感性相关。但IPASS临床试验显示EGFR基因拷贝数增加而无EGFR基因突变患者对EGFR-TKI治疗不能获益。 2.2EGFR拷贝数的改变 NSCLC中EGFR基因扩增较常见，并常伴EGFR蛋白过表达。基因扩增和7号染色体多倍体均可导致EGFR基因拷贝数增加。由于个体差异及实验技术的差别，EGFR扩增发生率12%-59%。部分研究表明EGFR基因的扩增常与TKI治疗后生存率高相关。EGFR基因拷贝数增加常与TKI治疗预后好相关。因此，基因拷贝数的增加可以作为预测TKI治疗反应性的一项指标。 EGFR体细胞突变与治疗反应率正相关具有肯定的结论。但EGFR基因拷贝数与EGFR-TKIs治疗反应性的关系尚未取得一致性的结果。总之，对于预测TKIs治疗反应性，EGFR突变比EGFR基因获得状态更特异、更敏感[9]。采用FISH检测EGFR拷贝数发现30%的NSCLC有EGFR高拷贝数，虽然这些患者的EGFR突变状态不清楚，但EGFR高拷贝数与TKI治疗反应性好相关。约70%EGFR高拷贝数患者同时伴有EGFR体细胞突变，这一点混淆了EGFR高拷贝数的真正意义。IPASS临床试验显示EGFR突变是延长无进展生存期最有效的预测因子。有些学者认为EGFR基因拷贝数可用作预测NSCLC患者EGFRTKI 反应及生存获益的指标[16]。但是IPASS临床试验证实EGFR基因高拷贝数而无EGFR基因突变患者对EGFR-TKI治疗不能获益。Hirsch等认为尽管EGFR突变及基因高拷贝数均能预测NSCLC患者Erlotinib ，而EGFR拷贝数是预测不同患者Erlotinib治疗生存获益更有利的指标。 检测EGFR基因拷贝数方法包括FISH，显色原位杂交(CISH)，实时定量PCR(qPCR)。采用PCR检测EGFR基因拷贝显示EGFR拷贝数增加与生存期延长显著相关，提示其潜在的预后价值[9，21]。EGFR基因获得可使疾病控制率从26%提高至67%，疾病进展期从2.5个月延长至9.0个月，生存时间从7个月延长至18.7个月。值得注意的是EGFR基因拷贝数作为预测TKI 的原因主要是其与EGFR突变相关。EGFR突变是比较好的 预测因子。Hirsch等进行的229例未经化疗的晚期NSCLC患者II期临床试验发现，如果FISH以多于40%的 细胞出现4个或更多拷贝数界定为拷贝数增加，76例患者中59.2%有EGFR基因拷贝数增加。EGFR有扩增患者(45%)对治疗的反应好于无扩增者(26%)。有EGFR扩增患者的中位无疾病进展期为6个月，而无EGFR扩增的为3个月。EGFR有扩增组的中位整体生存时间为15个月，而无EGFR的扩增组仅为7个月。 尽管大部分研究显示NSCLC患者EGFR基因高拷贝数与EGFR-TKIs治疗反应好及生存期长相关，但对其是否具有预后价值仍存在争论。有些研究认为作为筛选靶向治疗病人的预测指标，EGFR基因拷贝数的敏感性和特异性均劣于EGFR突变。Douillard等也证实作为治疗反应性及无疾病进展期的预测因子，EGFR突变优于EGFR拷贝数。 2.3EGFR蛋白过表达 尽管EGFR过表达的研究非常多，但结果却不尽如人意。40%-80%NSCLC患者有EGFR蛋白过表达，并且与预后差相关。最初设想EGFR抗体对治疗EGFR过表达患者可能有效。但早期临床试验提示EGFR过表达与抗EGFR抗体 无明确相关性。此外，应用免疫组织检测EGFR表达不能作为预测Cetuximab靶向治疗 的可靠手段。 部分研究显示免疫组化检测EGFR过表达与TKI治疗反应性好相关，但其它研究无类似结果。多因素分析显示EGFR表达水平与NSCLC治疗客观反应性及不良预后相关[18]。几项预后研究发现EGFR表达与生存获益不相关。因此，EGFR过表达不能作为NSCLC生存预测因子。不同研究结果之间的差异可能是由于免疫组化EGFR阳性判定的临界值及实验步骤无标准化指南有关。 2.4EGFR磷酸化 EGFR异常活化在 发展及演进中发挥着重要作用。此外，最新研究表明EGFR突变及EGFR磷酸化活化状态可影响NSCLC患者临床经过。两种主要EGFR信号途径：(PI3K)/Akt/mTOR和Ras/Raf/MAPK均参与EGFR引起 细胞增殖与存活。这些信号途径的活化依赖关键信号分子磷酸化的活化。NSCLC最主要的致瘤分子机制是活化性突变。调节EGFR表达的机制如表观遗传学及异常转录因子的研究尚未得出肯定结论。MicroRNA是EGFR调节因子。Weiss等检测3株NSCLC细胞株及NSCLC患者发现2株细胞株及55%的NSCLC患者有microRNA-128b的缺失。并且他们认为microRNA-128b可直接调节EGFR表达，microRNA-128b缺失与Gefitinib 好及生存期长相关。 EGFR激酶域第845位酪氨酸磷酸化可以稳定EGFR活化环，维持受体活化状态，提供与底物蛋白结合的位点。EGFR上另外两个酪氨酸磷酸化位点1068和1173可直接与GRB2直接结合，而且第1068位酪氨酸参与MAPK信号途径的活化。 EGFR活化可以通过抗EGFR磷酸化抗体检测EGFR磷酸化状态。EGFR基因C端磷酸化在募集信号分子及活化下游信号途径中发挥着重要作用。Endoh等短时间随访97例NSCLC患者发现，EGFR磷酸化抗体阳性患者生存期更长。Hijiya等应用免疫组化方法检测抗992及1173酪氨酸磷酸化抗体在21例NSCLC 组织表达情况，他们发现第992位酪氨酸磷酸化与EGFR基因突变相关密切，提示EGFR磷酸化抗体可替代EGFR突变检测，作为预测酪氨酸激酶抑制剂的 的指标。所以NSCLC患者应用免疫组化方法检测EGFR磷酸化状态可潜在预测EGFR靶向药物的 ，但仍需进一步临床验证。 2.5EGFRvIII EGFRvIII，一种最新发现的EGFR缺失突变体，是基因重排或mRNA剪切错误所致的第2至第7外显子编码序列框内缺失突变体。这种突变体比野生型EGFR少了267个氨基酸，在融合位点上形成了一个新的 。研究表明EGFRvIII突变体和野生型EGFR功能不同。尽管EGFRvIII不能与EGF等配体结合，但其自身酪氨酸激酶可组成性活化，受体自身磷酸化。NSCLC常有EGFRvIII表达，且表现为活化的磷酸化状态。因此，持续活化的EGFRvIII可能在肺癌发病中发挥重要作用，同时也可作为抗肺癌药物的潜在靶点。针对EGFRvIII的特异性抗体也可用于肺癌的靶向治疗。EGFRvIII特异性单克隆抗体可以抑制EGFRvIII高表达小鼠 细胞的生长，提高小鼠生存时间。EGFRvIII特异性抗体只与EGFRvIII突变体结合，不能与野生型EGFR结合，因此应用EGFRvIII抗体能更好的检出EGFRvIII突变体。 EGFRvIII突变体在NSCLC发病中的作用仍不太清楚。文献中报道EGFRvIII突变体在NSCLC患者检测率为0到42%。这些差异可能是由于检测 的组织学类型不同或者技术误差造成。免疫组化检测发现EGFRvIII突变体还存在于其它许多 。但是由于EGFR基因长、基因组结构复杂（含28个外显子，全长约为190kb）、第1内显子长（123kb）并且常发生基因缺失，因此在基因水平检测EGFRvIII突变非常困难。Okamoto等应用免疫组化检测EGFRvIII突变单克隆抗体在76例NSCLC的表达情况，发现EGFRvIII在39%(30/76)的NSCLC中表达；而基因分析检测EGFRvIII突变体仅为3%。他们还发现EGFRvIII也可以在正常肺组织中表达，因此对免疫组化检测EGFRvIII突变产生了质疑。 研究证实了小分子TKIs对有EGFR激酶突变NSCLC患者的临床靶向治疗有 。但是，这些小分子抑制剂是否能针对EGFRvIII突变尚不清楚。Ji等[32]报道EGFRvIII突变在人肺鳞癌中的表达率为5%(3/56)，但肺腺癌(0/123)中却无EGFRvIII突变。他们同时发现EGFRvIII突变的 对某些TKI有耐药性，而对另一些TKI却有反应性。体内实验证明，加入不可逆的EGFR抑制剂HKI-272一周后能明显缩小EGFRvIII致瘤小鼠的 体积。Erlotinib处理3只小鼠7天， 体积平均减少45%。而HKI-272处理后， 体积平均减少88%。转染EGFRvIII突变体的Ba/F3细胞对Gefitinib和Erlotinib耐药，而对HKI-272较敏感。因此，应用TKI对有EGFRvIII突变的肺癌患者具有潜在 。 三、EGFR检测和靶向治疗 由于EGFR过表达作为预后因子的研究缺乏重复性，研究者致力于EGFR突变型特异性结合的抗体的研制。CellSignaling公司(Danvers，MA)研制出两种针对EGFR最常见突变位点的特异性抗体：第19号外显子15-bp/5-氨基酸缺失突变(E746-A750del)和第21号外显子L858R点突变。Yu等用这两种抗体采用免疫组化的方法检测40例NSCLC标本中EGFR突变的基因型，并且每例均用DNA测序验证。这两种抗体也可用于Westernblotting、免疫荧光以及免疫组化染色。在340个石蜡包埋的NSCLC标本中应用这两种抗体，与DNA直接测序及质谱DNA测序相比，其敏感性和特异性分别为92%和99%。这表明应用突变特异性抗体是筛选预测肺癌患者EGFR靶向治疗 的一个快速、敏感、特异及经济有效的方法。Brevet等应用这两种EGFR突变特异性单克隆抗体在218例肺腺癌石蜡组织中进行免疫组化检测，发现采用1+为阳性临界值，EGFRL858R点突变抗体的敏感性为95%，阳性预测值为95%；若采用2+为阳性临界值，抗体的敏感性为76%，而阳性预测值为100%。因此，免疫组化检测EGFR突变特异性抗体可以用于筛选EGFR靶向治疗对象。 笔者提出的非小细胞肺癌患者分子检测流程(图3)。按肺癌突变的频率逐步进行分子检测，并对肺癌患者进行评估，从而给予相应的靶向治疗。 3.2EGFR靶向治疗 两种方法可以抑制EGFR信号途径：一种是通过EGFR单克隆抗体阻止配体与胞外域结合，另一种是应用小分子抑制胞内酪氨酸激酶活性。后者首先应用于临床。EGFR-TKIs是通过可逆的竞争性抑制ATP与EGFR-TK域的结合而发挥作用。体细胞EGFR活化突变，基因拷贝数增加，某些临床病理特征等与NSCLC患者靶向治疗 好和预后佳密切相关。但这些患者的大部分都具有EGFR-TKIs获得性耐药。EGFR基因二次突变位点T790M、表达HGF、PTEN和/或EGR-1以及上皮间质转化（EMT）均与EGFR-TKI耐药相关。Uramoto等发现8个T790M突变病例中6个高表达HGF，3个(38%)病例有PTEN缺失。7个病例中2个(29%)有EGR-1缺失，其中一个有PTEN缺失。7个病例中4个(57%)表达磷酸化Akt(p-Akt)。9个病例中4例(44%)在治疗过程中出现上皮间质转化（EMT）。因此EGFR-TKIs耐药机制涉及基因、蛋白等多因素的改变。 部分EGFR体细胞活化突变的NSCLC对酪氨酸激酶抑制剂具有反应。如上所述，获得性耐药与EGFR二次突变位点T790M相关。Bell等[20]报道一个家族中多个NSCLC的发生均与EGFRT790M突变相关。EGFR信号通路的改变是家族性NSCLC遗传易感的罪魁祸首，使家族肺癌患者增加。 3.2.1单克隆抗体 Cetuximab和Panitumumab是人/鼠嵌合或完全人源性抗EGFR胞外域单克隆抗体，它们通过抑制活化的配体与EGFR的结合而发挥作用。这种靶向治疗通过抑制配体依赖的EGFR的活化，从而抑制下游信号途径活化，达到缩短细胞周期进程、抑制细胞生长以及血管生成(图2A)。此外，EGFR单克隆抗体还能促进EGFR内化、降解，终止EGFR信号途径[26]。完全人源性抗体Panitumumab与EGFR亲和力高，其半衰期更长。尽管NSCLC患者常表达EGFR，但抗EGFR抗体仅对部分患者有效。 3.2.2酪氨酸激酶抑制剂 TKIs是人工合成的小分子，通过与ATP竞争性结合EGFRTK域。Gefitinib和Erlotinib是针对EGFR特异的酪氨酸激酶抑制剂，但同时也可抑制其他受体，如HER2和VEGFR2。TKIs通过结合酪氨酸激酶，阻断EGFR分子内自身磷酸化及酪氨酸激酶活化，阻止胞内下游信号途径的活化(图2B)。 四、EGFR靶向治疗耐药性机制 4.1二次突变引起的获得性耐药 尽管EGFR突变与Gefitinib和Erlotinib高敏感性相关，但仍有部分EGFR突变患者对EGFR-TKI治疗并不敏感。EGFR-TKIs耐药性可分为原发性耐药和治疗后引起继发性耐药。大部分病人对Gefitinib和Erlotinib初始治疗敏感，但最终可发展为耐药及疾病进展。 TKI药物敏感性相关的突变主要有四种：第18外显子点突变(G719A/C)、第21外显子点突变(L858R和L861Q)以及第19号外显子从第745位赖氨酸残基缺失4个高度保守性氨基酸(LREA)的框内缺失突变。此外第20外显子D770-N771插入突变也与EGFR-TKI耐药性相关。体外实验证实第20外显子插入突变对EGFR-TKIs反应性比第19和第21外显子点突变弱。 获得性耐药机制包括两个方面：其一是在治疗过程中EGFR基因出现了二次突变改变了EGFR蛋白质编码序列，其二是出现了其它原癌基因的扩增。 Kobayashi等报道一名接受Gefitinib治疗达完全缓解，两年后复发的NSCLC患者，其复发的 细胞除了有服药前的EGFR突变位点外，第20外显子上又出现了二次突变位点T790M。基因构象及生物化学的分析表明二次突变可导致Gefitinib耐药。Pao等几乎同时发现相同的突变位点T790M导致Gefitinib或Erlotinib获得性耐药。Gefitinib耐药病例EGFR激酶域均有T790M二次突变。第790位密码子被称为“管家密码子”，它决定了抑制剂与EGFR上ATP结合位点的特异性。EGFR第790位突变为甲硫氨酸，使EGFR空间结构改变，阻止与TKIsGefitinib或Erlotinib的结合，产生耐药。这个突变位点有利于 细胞存活，也可作为筛选TKI靶向治疗耐药基因的指标。这些耐药基因的发现推动了不可逆的EGFR-TKI靶向药物的发展，寻找更好的针对耐药的靶向药物。 EGFR下游癌基因KRAS、BRAF、PIK3CA和PTEN的活化在治疗反应中作用也成为研究热点。EGFR下游主要信号途径RAS/MAPK和PI3K/AKT均参与调节细胞增殖及存活。EGFR下游信号途径的突变也可导致EGFR-TKI耐药。研究发现MET激酶的扩增以及EML4-ALK融合基因的突变，可激活RAS/RAF/MEK通路，使EGFR抑制剂产生耐药。 4.2KRAS突变 KRAS在EGFR信号通路中发挥着重要作用，原癌基因KRAS编码的G蛋白是EGFR等生长因子活化下游Ras/MAPK信号通路的重要蛋白。 结直肠癌诊治最重要的发现之一是KRAS的突变状态与抗EGFR单克隆抗体（Panitumumab和Cetuximab）的靶向治疗 相关。部分 有KRAS基因第2号外显子体细胞突变，RAS-GTP水解为GDP，激活RAS信号途径。在KRAS突变的 中，KRAS蛋白持续活化，可以不依赖上游EGFR信号，从而对EGFR靶向药物Cetuximab或Panitumumab不敏感。 KRAS突变在肺癌患者中占15%-30%，在TKI治疗无效者中约占35%-45%。大约30%的肺腺癌具有KRAS活化突变，与EGFR-TKI耐药相关[40]。值得一提的是，KRAS突变在肺癌中比较常见，但是KRAS和EGFR突变同时存在却很少见。KRAS和EGFR突变很少同时出现在同一类型的 中，提示这些信号分子对NSCLC的发生和发展起着重叠作用。但是，越来越多证据显示少数情况下EGFR和KRAS突变可以同时存在。由于这种情况罕见，很难得出肯定结论，但是目前研究认为EGFR/KRAS突变与EGFR-TKI 负相关。 关于KRAS突变是否可以用于评估EGFR靶向治疗仍不清楚。尽管KRAS突变与EGFR-TKI治疗无反应相关，但与无疾病进展时间以及总体生存时间关系尚不清楚。小样本临床试验证实KRAS突变是接受EGFR-TKIs治疗的负相关预测因子，由于KRAS突变发生率低，目前缺乏大规模临床试验进一步验证。一些研究表明NSCLC中KRAS突变可作为抗EGFR单克隆抗体 的负相关预测因子，也在TKI耐药中发挥作用。与结直肠癌不同，在肺癌中KRAS突变不能作为筛选抗EGFR单克隆抗体治疗不能获益患者的指标。 KRAS突变出现在第2号外显子第12和13密码子，激活EGFR非依赖的胞内信号转导。Eberhard等[45]应用测序检测274位 患者EGFR第18-21号外显子和KRAS第2外显子突变情况，发现KRAS突变占21%，与Erlotinib联合化疗治疗后患者疾病进展时间及生存时间缩短相关。但有些报道认为KRAS突变不影响EGFR-TKI治 果。一项关于Erlotinib或Gefitinib单药治疗223例未接受化疗的进展期肺癌患者的研究发现，EGFR突变与67%治疗反应率相关。无论KRAS突变状态如何，野生型EGFR患者均与不良预后相关。 Wang等应用PCR-限制性片段长度多态性检测273位NSCLC患者KRAS基因12，13密码子突变[47]，120位患者接受了EGFR-TKI靶向治疗，KRAS突变患者中仅5.3%(1/19)对治疗有反应，而无KRAS突变患者治疗反应率为29.7%。KRAS突变患者中位无疾病进展期为2.5个月，而野生型KRAS患者中位无疾病进展期为8.8个月。 Linardou等应用Meta分析得出KRAS体细胞突变是晚期肺癌患者接受EGFR-TKI单药治疗 负相关预测因子。17篇文献中1008例NSCLC患者中165例(16%)有KRAS突变。KRAS突变与TKI治疗缺乏反应密切相关。 EGFR抑制剂获益的患者需具备完整的KRAS基因，但这一点并不足够，其他因素也可能产生对EGFR抑制剂耐药性。NSCLC患者KRAS突变占20%，其中少于3%患者同时具有EGFR突变，其余97%为野生型EGFR。KRAS/EGFR同时突变和EGFR野生型与EGFR靶向治疗无反应性相关。 4.3BRAF突变 KRAS和BRAF基因位于EGFR信号通路下游，是该信号通路的基本组成成分。BRAF蛋白是依赖KRAS-GTP活化的丝/苏氨酸激酶。BRAF主要功能包括通过磷酸化活化MAPK、MEK1和MEK2信号途径。突变的BRAF蛋白激酶活性增加，使NIH3T3细胞发生转化。不论KRAS是否有突变，BRAF突变都可促进 细胞生长。 BRAF与KRAS突变呈现相互排斥的现象。BRAF突变与腺癌的不同的组织学亚型具有相关性。Yousem等分析了222例无KRAS和EGFR突变的肺腺癌患者。其中10例腺癌有BRAF-V600E突变。BRAF突变常见于微 亚型。De等检测了15例原发微 型肺腺癌，发现3例(20%)有BRAF突变。BRAF-V600E突变在女性肺癌患者稍多（6：4）。老年人发生小叶内卫星结节及N2期淋巴结转移较多[48]。腺癌大部分是伴有 状亚型(80%)和细支气管肺泡亚型(50%)混合亚型腺癌。由于小样本量实验结果，目前仍不能肯定BRAF突变是否为肺癌独立的分子亚型。 结直肠癌患者中BRAF突变能降低Panitumumab或Cetuximab 。通过对132例患者的回顾性研究分析，治疗有效者均无BRAF突变，而79例无效患者中11位(14.0%)有BRAFV600E等位基因突变。 然而与KRAS相比，BRAF突变在NSCLC患者中检出率较低。据报道8%的BRAF突变位于BRAF激酶域。Brose等在292例NSCLC肺癌患者中发现5例(1.7%)有BRAF突变。其中，3例突变位于第11号外显子，2例突变位于第15号外显子。BRAF是EGFR下游信号分子，其是否能作为EGFR抑制剂 的预测分子仍需大量临床试验验证。V600E错义突变是BRAF蛋白质第600位密码子的缬氨酸被谷氨酸取代，90%恶性 中可以检测出这种突变。恶性 常出现丝氨酸-苏氨酸激酶BRAF点突变，它给部分NSCLC患者靶向治疗带来新的契机。 4.4ALK基因重排 间变淋巴瘤激酶(ALK)基因编码受体酪氨酸激酶，ALK融合蛋白是由ALK胞内激酶域和其它基因的氨基酸端组合而成。部分NSCLC患者基因组有EML4-ALK融合基因。目前肺癌 发现7个融合基因。所有融合基因的ALK胞内端酪氨酸激酶域均起始于第20号外显子编码的基因序列。EML4-ALK由第2号染色体短臂插入(p21；p23)引起，编码活化的蛋白酪氨酸激酶。有研究发现EML4-ALK基因融合是由EML4不同的外显子与ALK结合而成。ALK也可与其它基因结合形成融合基因，如KIF5B和TFG。活化的ALK通过激活下游PI3K/Akt和MAPK信号途径参与抑制细胞凋亡，促进细胞增殖。NSCLC人群中EML4-ALK融合基因阳性率很低，大约6%[50]。EML4-ALK基因融合以及EML4-ALK融合蛋白可活化RAS/RAF/MEK/MAPK信号途径。此外，其它两种少见的ALK融合基因也有报道。携带EML4-ALK融合基因的NSCLC患者均为野生型EGFR和KRAS。他们多为年轻人，发现时常为晚期，无吸烟史， 常呈实体型，且常出现印戒细胞。 一项关于携带EML4-ALK融合基因肺癌患者服用MET/ALK小分子抑制剂，PF-02341066的I/II期临床试验。19例携带EML4-ALK融合基因非小细胞肺癌患者，其中10例(53%)对PF-02341066客观 。其中15例（79%）在接受治疗8周后发现 受到抑制，部分患者维持到40周，仅有4例出现疾病进展。Kwak等发现1，500例晚期NSCLC患者中82例携带ALK融合基因。其中大部分(96%)为腺癌。94%患者既往接受过至少一项治疗。82位患者均接受口服crizotinib（ALKTKI小分子抑制剂）治疗，疾病控制率为90%，其中治疗反应率为57%，其余33%病情稳定。Rodig等探讨了关于西方人肺腺癌中ALK重排发生率以及重排特点，旨在优化临床检测ALK重排的模式。他们应用FISH和免疫组化检测358例肺腺癌标本，再次证明ALK重排与年轻患者，无吸烟史，临床呈进展期，组织学呈伴有印戒细胞的实体型腺癌相关。ALK重排不会同时伴有EGFR突变。这项研究证明西方人ALK重排少见，但却代表了一个独立的临床亚型，并且有可能对这类患者选择不同治疗方法。对于可疑病例，FISH和免疫组化同时验证对诊断肺腺癌ALK重排更准确[52]。Zhang等通过对266例中国NSCLC患者的研究，得出相似的结论。 Shaw等在141例NSCLC患者中发现19例（13%）有EML4-ALK融合基因，31例(22%)有EGFR突变，91例(65%)两者均为野生型[42]。其它研究也表明EML4-ALK和EGFR存在具有排斥性[42]。但是，Tiseo等报道一例48岁无吸烟史的白种人诊断为EGFR突变和ALK转位同时存在的肺癌患者，并且对Erlotinib耐药，这可能代表一小部分NSCLC患者。EML4-ALK重排人群中无EGFR突变，而EGFR突变人群无ALK重排[42]。转移肺癌患者，EML4-ALK重排与EGFR-TKI耐药相关。 与EGFR突变人群和野生型EGFR/ALK人群相比，EML4-ALK融合基因肺癌人群更年轻，男性居多[42]。但是，也有研究显示**相当。EML4-ALK融合基因肺癌人群更多是无或少吸烟史。19例EML4-ALK阳性肺癌中18例为腺癌，大部分为印戒细胞亚型。EML4-ALK代表NSCLC一种特殊的分子亚型。特别指出的是EML4-ALK融合基因肺癌患者不能获益于EGFR-TKI靶向治疗，需应用ALK靶向药物。 总之，以EGFR为靶点的治疗能有效治疗NSCLC患者。EGFR突变可作为筛选EGFR-TKI靶向治疗对象的指标，同时也可作为EGFR靶向 的预测因子。但是，越来越多证据显示NSCLC具有多种亚型，每种亚型都具有各自独特的分子改变。确定分子亚型、筛选靶向治疗人群的指标都是NSCLC个体化治疗的关键。EGFR及下游因子检测有助于筛选合理的治疗对象，KRAS/BRAF突变与EGFR突变存在相互排斥，很少同时出现在NSCLC患者。这也可能在肺癌病因学及EGFR-TKI靶向治疗耐药中发挥重要作用。总之，EGFR或其下游关键分子靶向治疗将成为未来NSCLC治疗的规范化治疗手段。联合预测模式不能应用于所有 类型，仍需更好地筛选合理治疗对象，EGFR分子指标仍需进一步研究并结合临床参数，更好指导NSCLC患者的治疗策略，实现真正的个体化诊治。